Detecção ultrassensível e visual do genótipo GII.4 ou GII.17 do norovírus humano usando CRISPR

Virology Journal volume 19, número do artigo: 150 (2022) Citar este artigo

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A integração de sensores CRISPR-Cas12a com amplificação de sinal isotérmico pode ser explorada para desenvolver ensaios ultrassensíveis, descartáveis ​​e de baixo custo para o diagnóstico de patógenos humanos.

Foram explorados ensaios de faixa de fluxo lateral e fluorescente em tempo real ou de ponto final (LFS) mediados por RT-RAA-Cas12a para detecção direta do genótipo GII.4 ou GII.17 do norovírus (NOV).

Os resultados mostraram que nosso ensaio fluorescente e LFS mediado por RT-RAA-Cas12a poderia detectar NOV GII.4 ou GII.17 visando o gene da proteína 1 viral. Nosso ensaio fluorescente e LFS mediado por RT-RAA-Cas12a pode detectar especificamente NOV GII.4 ou GII.17 sem reatividade cruzada para outros vírus relacionados. O limite baixo de detecção pode atingir 0,1 cópias/μL em aproximadamente 30-40 minutos, e os resultados foram visualizados usando um iluminador de luz ultravioleta ou em um LFS sem equipamento complexo. Além disso, nosso ensaio fluorescente e LFS mediado por RT-RAA-Cas12a forneceu uma alternativa visual e mais rápida ao ensaio RT-PCR em tempo real, com 95,7% e 94,3% de concordância preditiva positiva e 100% de concordância preditiva negativa.

Juntas, nossa abordagem mediada por RT-RAA-Cas12a teria um grande potencial para diagnósticos no local de atendimento de NOV GII.4 e/ou GII.17 em ambientes com recursos limitados.

Os norovírus humanos (NOVs) são agora reconhecidos como a principal causa da maioria de todas as gastroenterites não bacterianas [1]. NOVs são um grupo de vírus RNA que podem causar sintomas como vômitos agudos e diarreia, geralmente com duração de 48 horas em crianças e adultos saudáveis. Os NOVs são altamente infecciosos, pois mesmo algumas partículas podem causar doenças, e indivíduos infectados liberam grandes cargas de vírus [2, 3]. Os NOVs são transmitidos principalmente aos humanos através da exposição a alimentos e água contaminados como resultado do contato direto ou indireto com fezes humanas infectadas com NOV [4], ou dentro de aerossóis gerados pelo vômito de indivíduos infectados [5]. Como resultado da alta infecciosidade dos NOVs e da sua capacidade de transmissão eficiente, surtos de NOVs foram relatados globalmente em ambientes comunitários fechados, incluindo hospitais e lares de idosos, e, portanto, requerem medidas de intervenção para redução de infecções agressivas [6].

Os norovírus humanos possuem imensa diversidade genética com dez genogrupos diferentes (GI-GX) e pelo menos 48 genótipos identificados [7]. Sabe-se que os genogrupos GI, GII e GIV de NOVs estão associados à infecção humana. Entre cerca de 21 genótipos do NOV GII, o genótipo GII.4 foi responsável pela maioria dos casos clínicos de infecção disruptiva de NOVs na última década [8]. Recentemente, um novo genótipo de GII.17 de NOVs surgiu e se espalhou rapidamente para se tornar a cepa dominante de NOVs em algumas partes da Ásia, representando o risco de novas ameaças de surtos [9]. Até agora, com exceção de apenas alguns relatos sobre tratamento antiviral eficaz em humanos [10], não há atualmente nenhuma vacina licenciada de NOVs para humanos disponível [11]. Como resultado, uma detecção mais rápida e precoce da infecção por NOVs desempenha um papel significativo na facilitação da intervenção precoce, do tratamento e da prevenção de infecções, o que, por sua vez, pode mitigar o risco de transmissão do vírus infeccioso.

O padrão ouro atual para a detecção de NOVs são técnicas moleculares, incluindo reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), RT-PCR aninhada e RT-PCR em tempo real [12]. Entre esses métodos, o RT-PCR em tempo real tem sido extensivamente empregado para detectar ou diagnosticar a infecção por NoV devido à sua alta sensibilidade e especificidade, bem como ao baixo risco de contaminação por transferência. Atualmente, vários ensaios de RT-PCR em tempo real disponíveis comercialmente demonstraram a sensibilidade da RT-PCR em tempo real em 10–50 cópias/reação do genoma para NoV GI e 1–300 cópias/reação do genoma para NoV GII [13]. No entanto, o método RT-PCR em tempo real normalmente depende de equipamentos sofisticados e pessoal altamente qualificado, e tem um tempo médio de reação de aproximadamente 2 horas, o que não é adequado para procedimentos simples, rápidos e no local de atendimento (POC). ) ensaio molecular para diagnosticar infecção por NOVs em áreas com recursos limitados para detecção de rotina. Em um estudo recente, Sun et al. apresentou um método colorimétrico baseado em papel para detectar e distinguir os genótipos GII.4 e GII.17 de NOVs [14]. No entanto, o teste utilizando este método necessita de um tempo relativamente longo (~ 3 h), e a faixa de detecção é limitada entre 2,6 fM e 0,5 pM, sendo, portanto, menos sensível em comparação com RT-PCR [14]. Por outro lado, devido à excelente rapidez, sensibilidade e especificidade, o sistema de detecção de ácidos nucleicos baseado em nuclease agrupada guiada por RNA, consistindo em repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas (CRISPR) e suas nucleases associadas a CRISPR (Cas), mostrou recentemente um potencial considerável para explorar diagnósticos moleculares POC de próxima geração para patógenos infecciosos [15,16,17]. Atualmente, a eficácia de várias versões de nucleases Cas, incluindo Cas12a, Cas12b, Cas13a e Cas14, foi avaliada em ensaios in vitro e in vivo [18,19,20,21]. Entre essas nucleases, Cas12a (anteriormente Cpf1) é uma endonuclease classe II tipo V. Cas12a contendo um domínio de nuclease RuvC é conduzido por um único RNA CRISPR (crRNA) contendo uma sequência de motivo adjacente ao protoespaçador rico em T (PAM) para clivar DNA de fita dupla (dsDNA) em local específico, ou sem PAM para realizar clivagem de ssDNA inespecífica in trans in vitro [18]. Além disso, a combinação de nucleases Cas12a com amplificação de polimerase recombinase (RPA) ou RPA de transcrição reversa (RT-RPA) foi exaustivamente explorada para desenvolver o sistema CRISPR Trans Reporter (DETECTR) direcionado a endonuclease de DNA e aumenta significativamente a sensibilidade e especificidade da detecção de ácido nucleico [ 18].