Vitrificação automatizada de crio

Nature Communications volume 13, número do artigo: 2985 (2022) Citar este artigo

6379 Acessos

6 citações

13 Altmétrico

Detalhes das métricas

A velocidade e a eficiência da coleta de dados e processamento de imagens em microscopia crioeletrônica aumentaram na última década. No entanto, as técnicas de preparação de amostras criogênicas demoraram e são necessários dispositivos de preparação de amostras mais rápidos e reprodutíveis. Aqui, apresentamos um dispositivo de vitrificação com manuseio de amostras altamente automatizado, exigindo apenas interação limitada do usuário. Além disso, o aparelho permite a inspeção de filmes finos por meio de microscopia óptica, já que o excesso de líquido é retirado por sucção por tubos, e não por papel absorvente. Em combinação com o controle do ponto de orvalho, isso permite a preparação de filmes finos de maneira controlada e reprodutível. A vantagem é que a qualidade da amostra crio preparada é caracterizada antes da aquisição de dados de microscopia eletrônica. A praticidade e o desempenho do dispositivo são ilustrados com resultados experimentais obtidos por vitrificação de suspensões de proteínas, vesículas lipídicas, células bacterianas e humanas, seguidas de imagens usando análise de partículas únicas, tomografia crioeletrônica e microscopia óptica e eletrônica criocorrelacionada.

A fixação criogênica em água vítrea (gelo amorfo) por meio do congelamento rápido de amostras biológicas pode proporcionar uma preservação estrutural quase perfeita de amostras biológicas, como suspensões de proteínas, vírus, bactérias e células eucarióticas. A fixação criogênica requer uma taxa de congelamento alta o suficiente (>100.000 °C/s) para evitar a formação de gelo (cristal). Como resultado, a água adota um estado transitório metaestável, amorfo, semelhante a vidro. Usando a vitrificação, a estrutura das proteínas e células pode ser preservada em seu ambiente hidratado nativo até a resolução atômica. Amostras vitrificadas são compatíveis com as condições de vácuo exigidas para microscopia crioeletrônica (cryo-EM) e também podem ser estudadas com microscopia óptica de criofluorescência (cryofLM)2. A microscopia óptica e eletrônica correlativa (CLEM)3 reúne as vantagens do EM (alta resolução, contexto estrutural) com as vantagens da ampla gama de técnicas de microscopia óptica disponíveis (imagem ao vivo, rotulagem versátil)4,5.

A vitrificação por congelamento por imersão usando etano líquido, ou uma mistura de etano/propano como criogênico6, mostrou ser uma abordagem prática para a preparação criogênica de amostras biológicas de até 10 mícrons de espessura1,7. Para crio-EM, suspensões purificadas de proteínas e vírus são preservadas em finas camadas de água medindo várias dezenas de nanômetros, a partir das quais reconstruções de resolução atômica podem ser determinadas usando SPA8,9. Estruturas maiores, como bactérias e células aderentes com até alguns mícrons de espessura, também são adequadas para vitrificação. Reconstruções tridimensionais com resolução molecular podem ser determinadas usando tomografia crioeletrônica (crio-ET) de amostras de até aproximadamente meio mícron de espessura10,11. Minimizar a espessura da camada líquida é importante, uma vez que o meio ao redor da amostra dispersa elétrons, aumentando o ruído de fundo nas imagens, diminuindo assim a relação sinal-ruído nas imagens e reduzindo a resolução alcançável nas reconstruções tridimensionais resultantes.

A etapa essencial de gerar uma fina camada de amostra líquida em um suporte de amostra de microscopia eletrônica para EM (normalmente uma camada de carbono perfurada suportada por uma grade de cobre de 3,05 mm de diâmetro) é problemática, pois camadas finas de água são inerentemente instáveis ​​e têm controle exato sobre o a espessura da camada de água é difícil. Verificou-se que tornar o filme de suporte hidrofílico por descarga luminosa no ar ou alquilamina ajuda a formar uma fina camada líquida no filme de suporte e um ambiente úmido saturado ajuda a estabilizar a camada fina. A prática comum atual é aplicar vários microlitros de solução de amostra a um filme de suporte com descarga luminosa, seguido de remoção do excesso de fluido usando papel de filtro que é posteriormente congelado por imersão .